培養(yǎng)基是微生物培養(yǎng)的基質(zhì)，其質(zhì)量與使用方式直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。以下從配制、滅菌、接種到儲(chǔ)存等環(huán)節(jié)，系統(tǒng)闡述培養(yǎng)基的使用細(xì)節(jié)及關(guān)鍵控制點(diǎn)。
一、配制前的準(zhǔn)備
1. 配方確認(rèn)與計(jì)算
- 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇培養(yǎng)基類型(如營(yíng)養(yǎng)瓊脂、LB液體、沙保弱培養(yǎng)基等)，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)配方稱量成分。
- 注意特殊成分的處理：如酵母提取物、蛋白胨需充分溶解；痕量元素(如Mg²?、Ca²?)應(yīng)預(yù)先溶解后添加。
- 計(jì)算水量時(shí)需扣除其他液體成分(如葡萄糖溶液、維生素溶液)的體積。
2. 容器與工具準(zhǔn)備
- 使用玻璃或耐腐蝕塑料容器(如錐形瓶、培養(yǎng)皿)，避免金屬器具直接接觸培養(yǎng)基。
- 器皿需提前清洗并烘干，防止水分殘留導(dǎo)致滲透壓變化。
- 磁力攪拌器、pH計(jì)、電子天平等設(shè)備需校準(zhǔn)，確保測(cè)量精度。
二、配制與滅菌
1. 溶解與混合
- 按配方順序依次加入成分，先加水后加耐熱物質(zhì)(如瓊脂)，最后添加熱敏感物質(zhì)(如抗生素、血清)。
- 加熱時(shí)持續(xù)攪拌，避免局部過熱導(dǎo)致焦糊或成分分解。
- 瓊脂融化后需煮沸1-2分鐘，確保膠體均勻分布。
2. pH調(diào)節(jié)
- 冷卻至50-60℃時(shí)調(diào)節(jié)pH，使用精密pH計(jì)(誤差≤0.01)逐滴加入1mol/L NaOH或HCl。
- 避免過度調(diào)節(jié)：每滴酸堿可影響pH約0.2-0.3，需緩慢調(diào)整至目標(biāo)范圍(如大腸桿菌培養(yǎng)基pH 7.0±0.2)。
- 高溫下pH會(huì)因蒸發(fā)而升高，需預(yù)留0.1-0.2的補(bǔ)償值。
3. 滅菌操作
- 高壓蒸汽滅菌：液體培養(yǎng)基121℃、15分鐘；含糖培養(yǎng)基需115℃、20分鐘以防焦糖化。
- 過濾除菌：適用于熱敏感成分(如胎牛血清)，采用0.22μm濾膜正壓過濾。
- 滅菌后立即搖勻并冷卻，避免沉淀凝結(jié)或污染。
三、分裝與儲(chǔ)存
1. 分裝規(guī)范
- 固體培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿時(shí)需均勻鋪展，厚度約3-5mm，避免氣泡產(chǎn)生。
- 液體培養(yǎng)基按實(shí)驗(yàn)需求分裝(如試管裝量不超過1/5體積，搖瓶裝量為1/10)。
- 斜面培養(yǎng)基傾注后需靜置凝固，形成平整斜面。
2. 儲(chǔ)存條件
- 已滅菌培養(yǎng)基需在2周內(nèi)使用，4℃冷藏時(shí)密封避光，防止水分蒸發(fā)或污染。
- 含淀粉類成分的培養(yǎng)基易老化，需現(xiàn)配現(xiàn)用。
- 添加劑(如抗生素、指示劑)宜單獨(dú)儲(chǔ)存，使用時(shí)按需加入。
四、接種與培養(yǎng)
1. 無菌操作
- 接種前用75%酒精擦拭工作臺(tái)面，點(diǎn)燃酒精燈形成無菌區(qū)。
- 接種環(huán)需灼燒滅菌，待冷卻后挑取菌種，避免高溫殺死目標(biāo)菌。
- 劃線法接種時(shí)注意分區(qū)分離，第三區(qū)后不再返回前區(qū)，防止交叉污染。
2. 培養(yǎng)條件控制
- 溫度：嚴(yán)格按菌種需求設(shè)定(如大腸桿菌37℃、乳酸菌30℃、嗜熱菌55℃)。
- 氣體環(huán)境：厭氧菌需抽真空充氮或使用厭氧罐；CO?依賴菌需5%-10% CO?環(huán)境。
- 濕度與避光：培養(yǎng)箱內(nèi)放置水盤維持濕度，光敏感菌種需用黑袋包裹。
五、常見問題與應(yīng)對(duì)
1. 污染控制
- 霉菌污染：多因滅菌不干凈或操作時(shí)間過長(zhǎng)，需延長(zhǎng)滅菌時(shí)間或縮短接種流程。
- 細(xì)菌污染：可能來自吸管、槍頭或空氣，需更換無菌耗材并加強(qiáng)超凈臺(tái)維護(hù)。
- 支原體污染：定期檢測(cè)細(xì)胞系，使用含青霉素、支原體清除劑的培養(yǎng)基。
2. 培養(yǎng)基異常
- 不凝固：瓊脂濃度不足或pH過高，需補(bǔ)加瓊脂并重新滅菌。
- 顏色變化：指示劑失效或成分氧化，應(yīng)檢查原料有效期并避光保存。
- 菌落形態(tài)異常：滲透壓偏差或缺乏生長(zhǎng)因子，需復(fù)核配方并補(bǔ)充酵母提取物等。
六、特殊培養(yǎng)基的使用要點(diǎn)
1. 選擇性培養(yǎng)基(如麥康凱瓊脂)：
- 膽鹽、結(jié)晶紫需溶解，抑菌劑濃度需精確控制。
- 目標(biāo)菌(如大腸桿菌)應(yīng)形成典型菌落，抑制雜菌生長(zhǎng)。
2. 鑒別培養(yǎng)基(如伊紅美藍(lán)瓊脂)：
- 顯色反應(yīng)需在規(guī)定時(shí)間內(nèi)觀察，避免過度曝光導(dǎo)致顏色掩蓋。
3. 富集培養(yǎng)基(如GN增菌液)：
- 專性菌種優(yōu)先增殖，需配合選擇性平板進(jìn)行二次分離。
